巨細胞病毒感染

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巨細胞包涵體感染是由巨細胞病毒(cytomegalovirus,CMV)引起的先天性或后天性感染,有兩種類型,多數成為唾液腺的不顯性感染或慢性感染而長期存留。另一種是全身性疾病,稱巨細胞包涵體病(cytomegalic inclusion disease),比較少見,主要侵犯小嬰兒,其特點是在很多器官組織內發現含核內和胞漿內包涵體的巨大細胞,并伴有全身癥狀,是宮內病毒感染導致胎兒畸形的重要原因之一。 

CMV感染在全世界分布,人是CMV的唯一宿主。不同國家及不同經濟狀況感染率不同。成人CMV感染和免疫功能有密切關系。  

目錄

病原體

巨細胞病毒屬皰疹病毒群,具有典型的皰疹病毒樣結構,是一種大DNA病毒,直徑為80-110納米,病毒殼體為20面對稱體,含有162個殼粒。周圍有單層或雙層的類脂蛋白套膜。它有1個血清型,可分3個以上亞型。它只能在活細胞中生長,一般用人的纖維母細胞培養。它在體外生長緩慢,復制周期為36-48小時。被巨細胞病毒感染的細胞在光學顯微鏡下檢查可見到細胞和核變大,有包涵體形成。核內包涵體周圍與核膜間有一輪“暈”,因而稱為“貓頭鷹眼細胞”,這種細胞具有形態學診斷意義。  

診斷

單靠臨床表現不能診斷CMV感染,從臨床標本中分離出病毒,同時抗體呈出4倍以上增加或持續抗體滴度升高,將有助于診斷。  

一、病毒分離

最好用唾液、尿液、生殖道分泌物、乳汁和白細胞接種到人的成纖維細胞內繁殖和分離,細胞病變效應(CPE)在1天或數周后出現,經固定和HE染色后可觀察到巨細胞,核內有內包涵體,核周暈圈及嗜酸性胞漿內包涵體,很象“貓頭鷹眼”(owl′s eye)亦可用單克隆或多克隆抗體的熒光染色等方法檢查。  

二、血清抗體檢測

最常用的有補體結合試驗(CF)、間接免疫熒光試驗(IIF)、免疫酶試驗(EIA)、間接血凝試驗(IHA)和放射免疫試驗(RIA)等檢測CMV-IgG和IgM抗體。當單份血清標本已確定既往有CMV感染時,應當立即留血清標本,以及間隔2周、4周、8周再留血清標本,結合病毒分離可作原發感染診斷。  

三、DNA探針

已廣泛應用于檢測CMV,其中以32P標記的探針敏感性最高,對某些標本來說,雜交方法可能比病毒分離更敏感。  

四、聚合酶鏈式反應(PCR)

(一)標本的采集及處理

采集的標本包括患者的血液、尿,以及腺體組織等。由全血制備的血沉棕黃層(buffy coats)可保存于-80℃;尿液標本可保存于液氮中。凍存標本應避免反復凍融。

尿液標本經2500r/min離心10min,以除去細胞碎片,收集上清液。由于尿液中含有PCR抑制劑,因此需用聚乙二醇(PEG6000)進行預處理:50μl尿上清與50μl 20%PEG6000和25μl 2mol/L NaCl混合,置冰浴中6h;15000r/min離心30min收集沉淀。再于6400r/min離心3min;盡可能吸去上清,將沉淀懸浮于蒸餾水中。該懸液可直接用于PCR擴增;擴增時應于100℃加熱10min,迅速置冰浴中冷卻。

(二)模板DNA的制備

1.由血液標本制備模板DNA

方法A:向血清中加入NaCl使最終濃度為150mmol/L;取10μl 此血清于70℃處理45s后即可直接進行PCR擴增。

方法B:由血沉棕黃層(BCP)制備:① 用PBS洗滌BCP兩次,收取沉淀。② 加入500μl 6mol/L鹽酸胍,勻漿。③ 加入30μl 10mmol/L EDTA,10mmol/L NaCl,30μl20% Sarcosyl和5μl 蛋白酶K(10mg/ml),混合均勻,60℃反應1h。④ 加入1130μl 的乙醇,-20℃沉淀1~2h。⑤ 離心收集DNA沉淀。⑥ 用70%乙醇洗兩次,最后將沉淀懸浮于少量10mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA中。置4℃備用。

2.由冰凍組織標本制備模板DNA:① 用恒冷切片機切取一塊~10μm冰凍組織塊,置于1.5ml塑料管中。② 加入10%用緩沖液配制的福馬林。③ 10min后離心1~2min輕輕傾去上清液,沉淀用乙醇洗2次。④ 于室溫干燥10~60min。⑤ 加入抽提緩沖液(100mmol/L Tris-HCl,4mmol/L EDTA、pH8.0,400μg/ml蛋白酶K),使剛好浸沒沉淀物(約50~100μl );將沉淀搗碎。福馬林固定的或石蠟包埋組織經脫蠟和干燥后也可按此處理。⑥ 37℃放置過液。⑦ 置沸水中7min滅活蛋白酶K。⑧ 離心收集上清,取1~10μl 即可進行PCR擴增。

3.由尿液標本制備模板DNA:①100μl 尿上清液與100μl 6mol/L異硫氰酸胍,7μl 2mol/L NaCl和20μl 玻璃粉懸液(DNA PREP,Asahi Glass Co,Tokyo)混合。② 室溫放置10min后,6400r/min離心2min,收集沉淀。③ 沉淀用50%乙醇,10mmo/L Tris-HCl、pH7.4, 50mmol/L NaCl洗一次,6400r/min離心1min。④ 同樣洗滌沉淀2次,收集沉淀。⑤ 加入50μl 蒸餾水,于55℃作用15min。⑥ 15000r/min離心2min,收集上清(含HCMV DNA),進行PCR擴增,將此懸液于100℃加熱10min,并迅速于冰浴中冷卻。

(三)引物及探針

引物及探針的設計是根據已發表的CMV的直接早期蛋白基因啟動子區和開始的4個外顯子序列、晚期抗原gp64基因以及磷酸化蛋白pp71基因序列。常用的引物和探針列在表3中。

(四)PCR擴增步驟

1.10×反應緩沖液:100mmol/L Tris-HCl、pH8.4,500mmol/L KCl,25mmol/L MgCl2,2mg/ml明膠

Taq DNA 聚合酶:5U/μl 。

10×dNTP:4種dNTP各2.0mmol/L。

引物:100pmol/L。

2.常規PCR擴增

10×反應混合物(50μl)反應緩沖液 5μl

10×dNTP 5μl

模板DNA 5μl

Taq DNA聚合酶 0.2μl (IU)

引物 各0.5μl

蒸餾水 3.8μl

加1~2滴礦物油。

將反應混合物于94℃加熱5min;然后于95℃ 30s,55℃ 40s,72℃ 60s,擴增35~40循環。

3.套式(nested)PCR擴增:①反應混合物的組成同(2),僅引物為IE2a和IE4b(包括了整個外顯子3,共721b),各100pmol。于94℃ 60s,52℃150s,72℃ 480s,擴增20循環。② 取2μl 上述擴增產物,各加100pmol的引物IE3a和IE3b補加其他試劑。然后,于94℃ 60s,52℃150s,72℃180s,擴增20循環。  

(五)產物鑒定

擴增產物的分析可采用固相(濾膜)雜交和液相雜交試驗。

1. 固相雜交:

① 預雜交液為3×SSPE,5×Denhardt,0.5%SDS和25%甲酰胺.含有擴增產物的濾膜于42℃預雜交30~60min。② 加入標記探針(10cpm/μg,2ng/ml),雜交30~60min。③ 用0.2×SSPE,.01%SDS分別于室溫洗滌濾膜3次,5min/次;于60℃洗一次,10min/次;再于室溫洗一次以上,5min/次。④ 自顯影。

2. 液相雜交及電泳分析:

① 取1/10體積的擴增產物與0.5~1.0pmol末端記的探針混合。② 加入最終濃度為150mmol/L NaCl,10mmol/L磷酸鈉及1mmol/L EDTA溶液,使總體積為20μl 。③ 95℃ 10min,然后于56℃ 60min。④ 離心10s加入樣品緩沖液,于8%聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳。⑤ 電泳畢,用溴化乙錠染色,然后對X線片曝光,自顯影。

HCMV DNA分子很大,其堿基序列尚未全部搞清。雖然它的DNA的限制性內切酶片段長度具多形性,但是對其基因組的離散性還不清楚。用單一引物對進行PCR擴增,可鑒定90%的HCMV野型分離株;而采用針對不同HCMV序列的兩套以上的引物對,則可檢測幾乎所有的病毒株。因此,可根據情況使用兩對或兩對以上的位于基因組不同區域的引物進行PCR檢測。

在HCMV模板DNA制備過程中,有時會產生一些小片段DNA,在PCR反應時常導致一定水平的本底產物,從而影響對結果的判定。在這種情況下可采用套式PCR法,其基本原理就是靶DNA的擴增分為兩步:首先利用一對引物,擴增包括靶DNA在內的長片段DNA;然后取少量的擴增產物,利用只針對靶DNA的引物再進行第二次擴增。通過控制每步中的擴增循環數,即可防止由小片段DNA引起的假陽性。這種方法也可避免產生假陰性結果。

PCR檢測HCMV標本具有很高的敏感性。從HCMV感染的組織培養上清可檢測到相當于幾十個病毒的DNA分子或1~5PFU病毒的DNA序列。用非放射性寡核苷酸探針進行Southern雜交分析擴增產物,可從尿液標本中檢測到1pgHCMV DNA序列的水平;利用該系統,在4×104個細胞中只有一個病毒基因組即可檢測出,較斑點印跡雜交提高2×103倍。

PCR技術對HCMV感染的檢測具有臨床應用價值,因為體液中病毒DNA先于病毒感染的臨床癥狀血清學證據的出現,可作為HCMV感染的早期指標。由于HCMV可通過胎盤內感染、產道感染等途徑傳播,而且受感染的新生兒死亡率較高,因此利用PCR進行早期診斷及采取及時的治療措施,對優生優育也有重要意義。利用這種方法,還可鑒定器官或組織移植手術中供體是否為HCMV與許多嚴重病癥的關系。再者,PCR檢測指標穩定,還可進行半定量分析,因此可作為評價各種抗病毒藥物療效的手段。  

治療措施

巨細胞病毒感染的治療,可應用各種抗病毒制劑如GCV、抗巨細胞病毒的免疫球蛋白制劑、干擾素轉移因子等。但這些藥物并不能解決根本問題,往往停藥后病毒又潛伏地回升,鑒于此種病毒可能作為艾滋病的病因之一,各國學者均在致力于控制其感染的研究。最近,美國學者研制出兩種活疫苗,初試后頗見效。一種是由AD169菌株研制成的;另一種是從TOWn菌株制成的,經非腸道給藥后,已明顯表現出有抗巨細胞病毒的效能,CMV抗體升高,導致免疫功能增強。  

病原學

CMV屬于皰疹病毒群,是人類皰疹病毒組中最大的一種病毒,其形最大由162個殼粒(capsomer),正20面體構成。有典型的皰疹病毒結構。CMV只能在人纖維母細胞培養中增殖,而不能在其他動物細胞中生長,增殖非常緩慢,初次分離需一個多月才能出現特殊的細胞;細胞變園,膨脹,細胞及核巨大化,核周圍出現一輪“暈”的大型嗜酸性包涵體。

CMV在20%乙醚中最多存活2小時。pH<5時,或置于56℃30分鐘,或紫外線照射5分鐘可被充分滅活。CMV的感染性對凍融或存于-20℃或-50℃均不穩定,10%的家用漂白粉可使其感染性明顯降低。  

發病機理

CMV感染可引起機體的免疫功能降低,特別是細胞免疫功能下降。CMV感染對胸腺發育及脾細胞單核吞噬細胞、NK細胞及CTL細胞的功能有著顯著的影響。  

一、對胸腺、脾臟的影響

實驗室急性CMV感染的新生豚鼠,胸腺發育受抑,T細胞數減少,成年鼠感染CMV后,88%胸腺可檢出CMV。

CMV感染致脾功能受影響,脾臟淋巴細胞對conA刺激的增殖下降,脾細胞產生的IL-2顯著降低。  

二、對免疫細胞的影響

CMV感染引起的免疫抑制與病毒在細胞內的復制有關。CMV可以在單核吞噬細胞、T細胞、B細胞及一些尚未確定的單核細胞中復制,其中單核吞噬細胞最易感染CMV,淋巴細胞在免疫反應中具有重要的調節功能和效應功能。CMV感染后,可引起淋巴細胞的多種免疫功能受損。

CMV感染多表現為急性單核細胞增多癥。外周血淋巴細胞對有絲分裂原、CMV抗原和HSV抗原增殖反應減弱,誘導干擾素水平下降,CD4/CD8比值從1.7±0.7下降為0.2+0.2,T細胞活性降低.這種變化有的可持續相當長時間,病后10個月,大多數患者T細胞亞群比例仍未完全恢復正常。

CMV感染的免疫抑制作用主要是被病毒感染的大單核細胞和CD8細胞的功能異常所致。單核吞噬細胞在抗CMV免疫中起著樞紐作用,不但可以直接吞噬、殺傷病毒,更重要的是可以處理、提呈抗原,分泌細胞因子,調控和擴大免疫反應。當CMV感染后,單核吞噬細胞功能受到影響,CMV感染巨噬細胞引起其吞噬功能降低,細胞內氧自由基產生減少,FC受體補體受體的表達發生改變,且其抗原提呈功能降低,產生IL-1降低,對IL-1及IL-2的反應亦降低。Moses等用胸腺細胞增殖試驗檢測,IL-1活性降低,IL-1產生降低可引起TH/TS細胞比例失衡。

NK細胞有拮抗CMV擴散的作用。NK細胞積極參與了抗CMV感染的全過程,但存在高的NK活力不一定是保護性應答,而是活動性感染的證明。NK細胞雖不能阻止原發性CMV感染的出現,但一旦存在感染后,NK細胞能在CMV感染早期出現,有限制擴散、使感染局限的作用。NK細胞、CTL細胞是抗CMV的重要效應細胞。在CMV復制早期,感染性病毒體產生前,它們能裂解感染細胞,使病毒在細胞間擴散流產。在小鼠模型中,病毒作用了3-5天時,抗病毒效應由NK細胞介導,NK細胞活性可由IFN增強。6-21天,脾、外周血存在CTL細胞的殺傷活性。NK細胞、CTL細胞活性的高低決定了機體對CMV感染的敏感性及感染恢復的難易性。但CMV感染時,NK細胞及CTL細胞活性亦受到嚴重影響。此外,特異性細胞免疫有阻止CMV感染再發作用。有人檢測了20個發生CMV感染腎移植受者T細胞應答,發現有14個有CMV細胞毒應答,而6個不出現細胞毒應答者有嚴重的臨床后果。因此,特異性T細胞存在,有阻止CMV感染再發的作用。  

三、抗體有降低CMV感染的毒力作用

機體受CMV的感染后,可出現多種抗體。乳汁、宮頸分泌物、唾液中盡管有特異性抗體出現,包括中和抗體。但仍能檢出CMV,說明抗體并不能阻止病毒擴散。胎兒從母體被動獲得的抗體不能阻斷經宮內、產道或乳汁傳播的感染。研究證明,致死性CMV攻擊前,在小鼠腹腔或靜脈注入0.2ml高效價抗CMV球蛋白,可完全保護動物免于死亡。1個月后再用CMV等二次攻擊,動物仍全部存活,表明抗體有降低CMV的毒力作用。

初次感染后,CMV將在宿主細胞中無限期存在成潛伏狀態。可能累及多種組織器官,尸檢提示肺、肝、胰、唾液腺中樞神經系統及腸也可能是病毒潛伏場所。先天性感染的嚴重程度,與缺乏產生沉淀抗體的能力和T細胞對CMV的應答有關。兒童和成年人感染CMV后,在外周血中出現具有抑制細胞表型活化T淋巴細胞,如果宿主的T細胞功能受損,潛伏的病毒就可能復活并引起多種癥候群。組織移植后發生的慢性刺激,為CMV活化,誘發疾病提供了條件。某些針對T細胞的強烈免疫抑制劑抗胸腺細胞球蛋白,與臨床CMV癥候群高發率有關。此外,CMV在功能上可作為輔助因子,使潛伏感染的HIV活化。  

流行病學

CMV感染在全世界分布,人是CMV的唯一宿主。不同國家及不同經濟狀況感染率不同。成人CMV感染和免疫功能有密切關系。如因器官移植而接受免疫抑制劑治療者,常因所供器官和輸入血液中有潛伏病毒,或免疫抑制使潛伏的病毒活化而發病,艾滋病患者的CMV感染發病率高。

傳染源是病人及其急性帶毒者,病毒可由乳汁、唾液及尿排出,可持續數周到幾年,人類易于感染,傳播途徑多種多樣。屬于性傳播性疾病。多從精液,宮頸分泌物,淚液及糞便(口腔性欲,吻肛)感染所致。

同源性CMV感染是輸血和器官移植的一種嚴重危害,多次輸血或一次大量輸血使原發和再發感染的危險性增高,輸入含白細胞血液的危險性更高,器官或骨髓移植術后CMV感染率也高。  

臨床表現

CMV感染的自然史很復雜,在原發性感染以后排毒,往往持續數周、數月甚至數年,然后感染轉為潛伏。常有復發感染伴重新排毒。甚至在原發感染后很多年,潛伏病毒再激活,也可能有不同抗原性病毒株的再感染。CMV感染的臨床表現與個體免疫功能和年齡有關。不論從垂直感染、平行傳播或醫源性感染所出現的癥狀與體征都是多種多樣的。

關于后天性CMV感染癥,在臨床中常見于輸血后的單核細胞增多癥,由于免疫功能缺陷而發生血管網膜炎肺炎以及消化道感染。并且大多數患者合并格-巴氏綜合征。  

巨細胞病毒感染傳染源

傳染源是患者和無癥狀的隱性感染者。他們可長期或間歇地自唾液、精液、尿液、乳液和子宮頸分泌物中排出病毒。如果與有巨細胞病毒感染的異性性交,而恰好此人此時處于排毒期,則可能被感染。如果孕婦在性生活時染上病毒,則可引起胎兒感染和圍產期感染。據統計,由原發性巨細胞病毒感染的孕婦所造成的新生兒的感染率可高達23%,而圍產期感染比宮內感染的百分率更高。有人報道約13%的母親的初乳和乳汁中有病毒排出。此外,輸血也常發生巨細胞病毒感染,感染的發生率與輸血的數量呈正比,尤其是當血清陽性的供血者給血清陰性的受血者輸血時,其感染的危險性最高。此外,長期接受免疫抑制劑治療的腎移植者中,有90%在尿中可查到病毒,或抗體明顯增高。艾滋病患者比正常人更易遭受病毒感染,或使原潛伏在體內的病毒復活。

參考